糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei)（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原(yuan)分解代(dai)謝(xie)的(de)關(guan)鍵酶(mei)，使糖原(yuan)分子從非(fei)還(hai)原(yuan)端逐(zhu)個(ge)斷(duan)開(kai)α-1，4-糖苷(gan)鍵(jian)移去葡萄糖基(ji)，釋(shi)放 1-磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖，直(zhi)至(zhi)臨(lin)近糖原(yuan)分子α-1，6-糖苷(gan)鍵(jian)分支(zhi)點(dian)前(qian) 4 個(ge)葡(pu)萄糖基(ji)處。GP 分為有(you)活(huo)性的(de)糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei) a（GPa）和無(wu)活(huo)性的(de)糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei) b（GPb）兩(liang)種形式。糖原(yuan)的(de)分解主(zhu)要在(zai) GPa 的(de)催(cui)
糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei)a試劑(ji)盒(he)

糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei) a（Glycogen phosphorylase a，GPa）試劑(ji)盒(he)說(shuo)明書

微(wei)量(liang)法(fa) 100 管(guan)/96 樣

糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei)a試劑(ji)盒(he)

正(zheng)式測定(ding)前務(wu)必(bi)取(qu) 2-3 個預(yu)期差異(yi)較大(da)的樣本(ben)做預(yu)測定(ding)測定(ding)意義(yi)：

糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei)（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原(yuan)分解代(dai)謝(xie)的(de)關(guan)鍵酶(mei)，使糖原(yuan)分子從非(fei)還(hai)原(yuan)端逐(zhu)個(ge)斷(duan)開(kai)α-1，4-糖苷(gan)鍵(jian)移去葡萄糖基(ji)，釋(shi)放 1-磷(lin)酸(suan)葡萄(tao)糖，直至(zhi)臨(lin)近糖原(yuan)分子α-1，6-糖苷(gan)鍵(jian)分支(zhi)點(dian)前(qian) 4 個葡(pu)萄(tao)糖基(ji)處。GP 分為有(you)活(huo)性的(de)糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei) a（GPa）和無(wu)活(huo)性的(de)糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei) b（GPb）兩(liang)種形式。糖原(yuan)的(de)分解主(zhu)要在(zai) GPa 的催(cui)化(hua)下進行。

測定(ding)原理(li)：

未添加激(ji)活(huo)劑(ji)時(shi)，GPa 催(cui)化(hua)糖原(yuan)和無(wu)機(ji)磷(lin)產(chan)生(sheng)葡萄糖殘基(ji)生成(cheng)糖原(yuan)和 1-磷酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖，磷(lin)酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖變(bian)位酶(mei)和 6-磷酸(suan)葡(pu)萄(tao)糖脫(tuo)氫酶(mei)進壹步(bu)依次催(cui)化(hua) NADP 還(hai)原(yuan)生成(cheng)NADPH，在(zai) 340nm 下測(ce)定(ding)NADPH 上升(sheng)速(su)率(lv)，即可(ke)反(fan)映GPa 活(huo)性。

組成(cheng)：

自(zi)備(bei)儀(yi)器和用品：

紫外分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)/酶(mei)標儀(yi)、臺式離心(xin)機(ji)、可(ke)調(tiao)式移液(ye)器、微(wei)量(liang)石英比色皿(min)/96 孔(kong)板(ban)、研缽(bo)、冰和蒸餾水。

樣本(ben)的(de)前(qian)處(chu)理(li)：

按照(zhao)組(zu)織(zhi)質量(liang)（g）：提取(qu)液(ye)體(ti)積(ml)為 1：5~10 的比例(li)（建議稱(cheng)取(qu)約(yue) 0.1g 組(zu)織，加入 1ml 提取(qu)液(ye)），進行冰浴勻(yun)漿。8000g 4℃離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清，置冰上待(dai)測(ce)。

測定(ding)步驟：

1、分光(guang)光(guang)度(du)計(ji)或(huo)酶(mei)標儀(yi)預(yu)熱 30min 以上，調(tiao)節(jie)波長(chang)至(zhi) 340nm，蒸餾水調零(ling)；

2、工作液(ye)的配(pei)制(zhi)：臨用前將(jiang)試劑(ji)二轉移到試劑(ji)壹(yi)中(zhong)混(hun)合溶(rong)解待(dai)用；用(yong)不(bu)完(wan)的試劑(ji)分裝(zhuang)後(hou)-20℃保存(cun)，禁(jin)止(zhi)反(fan)復(fu)凍融(rong)。

3、試劑(ji)三的配(pei)制(zhi)：臨用前在(zai)試劑(ji)三管(guan)中(zhong)加入 1ml 蒸餾水充分溶解待(dai)用(yong)；用不(bu)完(wan)的試劑(ji)分裝(zhuang)後(hou)-20℃保存(cun)，禁(jin)止(zhi)反(fan)復(fu)凍融(rong)。

4、試劑(ji)四(si)的(de)配(pei)制(zhi)：臨用前在(zai)試劑(ji)四(si)管(guan)中(zhong)加入 1ml 蒸餾水充分溶解待(dai)用(yong)；用不(bu)完(wan)的試劑(ji)分裝(zhuang)後(hou)-20℃保存(cun)，禁(jin)止(zhi)反(fan)復(fu)凍融(rong)。

5、將(jiang)工作液(ye)、試劑(ji)三和試劑(ji)四(si)置於 37℃預(yu)熱 5 分鐘；

6、在(zai)微(wei)量(liang)石英比色皿(min)或(huo) 96 孔(kong)板(ban)中(zhong)加入 10μl 樣本(ben)、10μl 試劑(ji)三、10μl 試劑(ji)四(si)、10μl 蒸餾水和 160μl 工作液(ye)，立即混(hun)勻(yun)，記錄 340nm 處(chu) 5min 後(hou)的(de)A1 和 10min 後(hou)的(de)吸(xi)光(guang)值(zhi)A2，計(ji)算(suan)ΔA=A2-A1。

GPa 活(huo)性計(ji)算(suan)：

用微(wei)量(liang)石英比色皿(min)測定(ding)的計(ji)算公式如下(xia)：

按樣本(ben)蛋白濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織蛋白每(mei)分鐘產(chan)生(sheng) 1nmol NADPH 定(ding)義(yi)為壹個(ge)酶(mei)活(huo)力單(dan)位(wei)。

GPa（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

按樣本(ben)鮮(xian)重計算

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分鐘產(chan)生(sheng) 1nmol NADPH 定(ding)義(yi)為壹個(ge)酶(mei)活(huo)力單(dan)位(wei)。

GPa（nmol/min/g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=643×ΔA÷W

V 反(fan)總：反(fan)應體(ti)系(xi)總體(ti)積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩(mo)爾(er)消光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿(min)光(guang)徑(jing)， 1cm；V 樣：加(jia)入樣本(ben)體(ti)積，0.01 ml；V 樣總：加(jia)入提取(qu)液(ye)體(ti)積，1 ml；T：反(fan)應時(shi)間(jian)，5 min；Cpr：樣本(ben)蛋白質濃度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質量(liang)，g。

用 96 孔(kong)板(ban)測定(ding)的計(ji)算公式如下(xia)：

按樣本(ben)蛋白濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組(zu)織蛋白每(mei)分鐘產(chan)生(sheng) 1nmol NADPH 定(ding)義(yi)為壹個(ge)酶(mei)活(huo)力單(dan)位(wei)。

GPa（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

按樣本(ben)鮮(xian)重計算

單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)g 組(zu)織每(mei)分鐘產(chan)生(sheng) 1nmol NADPH 定(ding)義(yi)為壹個(ge)酶(mei)活(huo)力單(dan)位(wei)。

GPa（nmol/min/g 鮮(xian)重）＝[ΔA×V 反(fan)總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=1286×ΔA÷W

V 反(fan)總：反(fan)應體(ti)系(xi)總體(ti)積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩(mo)爾(er)消光(guang)系(xi)數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔(kong)板(ban)光(guang)徑(jing)， 0.5cm；V 樣：加(jia)入樣本(ben)體(ti)積，0.01 ml；V 樣總：加(jia)入提取(qu)液(ye)體(ti)積，1 ml；T：反(fan)應時(shi)間(jian)，5 min；Cpr：樣本(ben)蛋白質濃度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質量(liang)，g。

糖原(yuan)磷(lin)酸(suan)化(hua)酶(mei)a試劑(ji)盒(he)