糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei)（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是(shi)糖(tang)原分(fen)解代謝的關(guan)鍵酶，使(shi)糖(tang)原分(fen)子從(cong)非(fei)還原端(duan)逐(zhu)個(ge)斷開(kai)α-1，4-糖(tang)苷鍵移去葡(pu)萄(tao)糖(tang)基，釋(shi)放 1-磷(lin)酸葡萄糖(tang)，直(zhi)至(zhi)臨(lin)近(jin)糖(tang)原分(fen)子α-1，6-糖(tang)苷鍵分支(zhi)點前 4 個(ge)葡(pu)萄糖(tang)基處。GP 分為有(you)活(huo)性(xing)的糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei) a（GPa）和(he)無活(huo)性(xing)的糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei) b（GPb）兩(liang)種(zhong)形式。GPb 在壹(yi)定濃(nong)度(du)的腺苷酸(suan)（5
糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei)b試(shi)劑盒(he)

糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei)b（Glycogen phosphorylase b，GPb）試(shi)劑盒(he)說(shuo)明(ming)書(shu)

微量(liang)法(fa) 100 管/48 樣(yang)

糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei)b試(shi)劑盒(he)

正式測(ce)定前務必取(qu) 2-3 個(ge)預(yu)期差(cha)異較(jiao)大(da)的樣本(ben)做(zuo)預(yu)測(ce)定測(ce)定意義(yi)：

糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei)（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是(shi)糖(tang)原分(fen)解代謝的關(guan)鍵酶，使(shi)糖(tang)原分(fen)子從(cong)非(fei)還原端(duan)逐(zhu)個(ge)斷開(kai)α-1，4-糖(tang)苷鍵移去葡(pu)萄(tao)糖(tang)基，釋(shi)放 1-磷(lin)酸葡(pu)萄(tao)糖(tang)，直(zhi)至(zhi)臨(lin)近(jin)糖(tang)原分(fen)子α-1，6-糖(tang)苷鍵分支(zhi)點前 4 個(ge)葡(pu)萄糖(tang)基處。GP 分(fen)為有(you)活(huo)性(xing)的糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei) a（GPa）和(he)無活(huo)性(xing)的糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei) b（GPb）兩(liang)種(zhong)形式。GPb 在壹(yi)定濃(nong)度(du)的腺苷酸(suan)（5，-AMP）存在下可被激活。

測(ce)定原(yuan)理：

GP 催(cui)化糖(tang)原和(he)無機(ji)磷產(chan)生葡(pu)萄(tao)糖(tang)殘(can)基生成(cheng)糖(tang)原和(he) 1-磷(lin)酸(suan)葡萄糖(tang)，磷(lin)酸(suan)葡萄糖(tang)變(bian)位(wei)酶(mei)和(he) 6-磷酸(suan)葡萄(tao)糖(tang)脫(tuo)氫酶(mei)進(jin)壹(yi)步依次催(cui)化NADP 還原生成(cheng)NADPH，在 340nm 下(xia)測(ce)定NADPH 上(shang)升(sheng)速(su)率，即(ji)可反映 GP 活(huo)性(xing)。添加(jia)壹(yi)定濃(nong)度(du)的腺苷酸(suan)（5，-AMP）時(shi)測(ce)定GP（GPa 和(he)GPb）活性(xing)，未添加(jia)腺(xian)苷酸(suan)（5，-AMP）時(shi)測(ce)定GPa活(huo)性(xing)，GP 活性(xing)－GPa 活(huo)性(xing)得到(dao)GPb 活性(xing)。

組(zu)成(cheng)：

自備儀(yi)器(qi)和(he)用(yong)品：

紫外(wai)分(fen)光(guang)光度(du)計/酶標(biao)儀(yi)、臺(tai)式離(li)心機、可調式移液(ye)器、微量(liang)石英比(bi)色皿/96 孔(kong)板(ban)、研缽、冰和(he)蒸餾(liu)水。

樣(yang)本(ben)的前處理：

按(an)照(zhao)組(zu)織(zhi)質(zhi)量(liang)（g）：提取液(ye)體積(ji)(ml)為 1：5~10 的比(bi)例（建(jian)議稱取(qu)約(yue) 0.1g 組織(zhi)，加入(ru) 1ml 提取液(ye)），進(jin)行(xing)冰浴(yu)勻(yun)漿(jiang)。8000g 4℃離(li)心 10min，取上(shang)清(qing)，置冰上待(dai)測(ce)。

測(ce)定步驟(zhou)：

1、分(fen)光(guang)光度(du)計或(huo)酶(mei)標(biao)儀(yi)預(yu)熱(re) 30min 以上(shang)，調節波長至(zhi) 340nm，蒸(zheng)餾(liu)水調零；

2、工(gong)作(zuo)液(ye)的配制：臨用(yong)前將試劑二轉移到試(shi)劑壹(yi)中混合溶(rong)解待用(yong)；用(yong)不完的試劑分裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復(fu)凍融(rong)。

3、試(shi)劑三的配制：臨用(yong)前在試劑三瓶(ping)中加入(ru) 1ml 蒸餾(liu)水充分溶(rong)解待用(yong)；用(yong)不完的試劑分裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復(fu)凍融(rong)。

4、試(shi)劑四(si)的配制：臨用(yong)前在試劑四(si)瓶中加入(ru) 1ml 蒸餾(liu)水充分溶(rong)解待用(yong)；用(yong)不完的試劑分裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復(fu)凍融(rong)。

5、試(shi)劑五(wu)的配制：臨用(yong)前在試劑五(wu)管中加入(ru) 500μl 蒸餾(liu)水充分溶(rong)解待用(yong)；用(yong)不完的試劑分裝(zhuang)後(hou)-20℃保(bao)存(cun)，禁(jin)止反復(fu)凍融(rong)。

6、將工(gong)作(zuo)液(ye)、試劑三、試(shi)劑四(si)和(he)試劑五(wu)置於(yu) 37℃預(yu)熱(re) 5 分鐘(zhong)；

7、在微量(liang)石英比(bi)色皿或(huo) 96 孔(kong)板(ban)中加入(ru) 10μl 樣本、10μl 試(shi)劑三、10μl 試(shi)劑四(si)、10μl 蒸餾(liu)水和(he) 160μl 工(gong)作(zuo)液(ye)，立(li)即(ji)混勻(yun)，記(ji)錄 340nm 處 5min 後(hou)的A1 和(he) 10min 後(hou)的吸光(guang)值(zhi)A2，計算ΔAGPa=A2-A1。

8、在微量(liang)石英比(bi)色皿或(huo) 96 孔(kong)板(ban)中加入(ru) 10μl 樣本、10μl 試(shi)劑三、10μl 試(shi)劑四(si)、10μl 試劑五(wu)和(he) 160μl 工(gong)作(zuo)液(ye)，立(li)即(ji)混勻(yun)，記(ji)錄 340nm 處 5min 後(hou)的A3 和(he) 10min 後(hou)的吸光(guang)值(zhi)A4，計算ΔAGP=A4-A3。

註(zhu)意：由於(yu)每(mei)個(ge)樣(yang)本需要同(tong)時(shi)測(ce)壹(yi)個(ge) GP（GPa 和(he)GPb）活性(xing)和(he)壹(yi)個(ge)GPa 活(huo)性(xing)，因此(ci)本試(shi)劑盒(he) 100 管測(ce) 48個(ge)樣(yang)本。

GPb 活(huo)性(xing)計算：

用(yong)微量(liang)石英比(bi)色皿測(ce)定的計算公(gong)式如(ru)下(xia)：

按(an)樣本(ben)蛋白濃(nong)度(du)計算

單位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組織蛋白每分鐘(zhong)產(chan)生 1nmol NADPH 定(ding)義(yi)為壹(yi)個(ge)酶(mei)活力單位(wei)。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ ΔAGPa)÷Cpr

按(an)樣本(ben)鮮重(zhong)計算

單位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)g 組織每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生 1nmol NADPH 定(ding)義(yi)為壹(yi)個(ge)酶(mei)活力單位(wei)。

GPb（nmol/min/g 鮮(xian)重(zhong)）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣(yang)總)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V 反總：反應(ying)體系總體積(ji)，2×10-4 L；ε：NADPH 摩(mo)爾(er)消光(guang)系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色皿光(guang)徑， 1cm；V 樣：加入(ru)樣本體積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總：加入(ru)提取液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時(shi)間(jian)，5 min；Cpr：樣(yang)本蛋白質濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質量(liang)，g。

用(yong) 96 孔板(ban)測(ce)定的計算公(gong)式如(ru)下(xia)：

按(an)樣本(ben)蛋白濃(nong)度(du)計算

單位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)mg 組織蛋白每分鐘(zhong)產(chan)生 1nmol NADPH 定(ding)義(yi)為壹(yi)個(ge)酶(mei)活力單位(wei)。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×(ΔAGP－ ΔAGPa)÷Cpr

按(an)樣本(ben)鮮重(zhong)計算

單位(wei)定(ding)義(yi)：每(mei)g 組織每(mei)分(fen)鐘(zhong)產(chan)生 1nmol NADPH 定(ding)義(yi)為壹(yi)個(ge)酶(mei)活力單位(wei)。

GPb（nmol/min/g 鮮(xian)重(zhong)）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣(yang)總)÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V 反總：反應(ying)體系總體積(ji)，2×10-4 L；ε：NADPH 摩(mo)爾(er)消光(guang)系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板(ban)光徑， 0.5cm；V 樣：加入(ru)樣本體積(ji)，0.01 ml；V 樣(yang)總：加入(ru)提取液(ye)體積(ji)，1 ml；T：反應(ying)時(shi)間(jian)，5 min；Cpr：樣(yang)本蛋白質濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣本(ben)質量(liang)，g。

糖(tang)原磷(lin)酸化酶(mei)b試(shi)劑盒(he)