PFP 催(cui)化(hua) 6-磷(lin)酸(suan)果(guo)糖(tang)轉(zhuan)化(hua)為(wei) 1,6-二磷(lin)酸(suan)果(guo)糖(tang)，它(ta)在(zai)醛(quan)縮(suo)酶(mei)和(he)磷(lin)酸(suan)丙糖(tang)異(yi)構酶(mei)的作(zuo)用下(xia)轉變(bian)為(wei) 3-磷(lin)酸(suan)甘油(you)醛，再(zai)由 3-磷(lin)酸(suan)甘油(you)醛脫氫酶(mei)和(he)NADH 催(cui)化(hua)生(sheng)成(cheng) 3-磷(lin)酸(suan)甘油(you)酸(suan)、NAD 和(he)磷(lin)酸(suan)，340nm 處的吸(xi)光度變(bian)化(hua)反(fan)映(ying)了PFP 的活(huo)性(xing)的高低(di)。
焦(jiao)磷(lin)酸(suan)果(guo)糖(tang)-6-磷(lin)酸(suan)-1-磷(lin)酸(suan)轉移(yi)酶(mei)試劑盒(he)光合

焦(jiao)磷(lin)酸(suan)：果(guo)糖(tang)-6-磷(lin)酸(suan)-1-磷(lin)酸(suan)轉移(yi)酶(mei)（Pyrophosphate: fructose-6 –phosphate-1-phosphoric acid transferase，PFP）試(shi)劑盒(he)說明(ming)書

分光光度法 50 管(guan)/48 樣

焦(jiao)磷(lin)酸(suan)果(guo)糖(tang)-6-磷(lin)酸(suan)-1-磷(lin)酸(suan)轉移(yi)酶(mei)試劑盒(he)光合

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)前(qian)務必取(qu) 2-3 個(ge)預期差(cha)異(yi)較大的(de)樣本做(zuo)預測定(ding)測(ce)定(ding)意(yi)義：

焦(jiao)磷(lin)酸(suan)：果(guo)糖(tang)-6-磷(lin)酸(suan)-1-磷(lin)酸(suan)轉移(yi)酶(mei)（PFP，EC2.7.1.90）是(shi)壹(yi)種胞(bao)質(zhi)酶(mei)，廣泛存(cun)在(zai)於(yu)植物(wu)組(zu)織中，催(cui)化(hua)果(guo)糖(tang)-6-磷(lin)酸(suan)與果(guo)糖(tang)-1,6-二(er)磷(lin)酸(suan)之間的可(ke)逆轉(zhuan)化(hua)，在(zai)光合作(zuo)用碳(tan)代謝(xie)中起重(zhong)要(yao)作(zuo)用。

測(ce)定(ding)原(yuan)理：

PFP 催(cui)化(hua) 6-磷(lin)酸(suan)果(guo)糖(tang)轉(zhuan)化(hua)為(wei) 1,6-二磷(lin)酸(suan)果(guo)糖(tang)，它(ta)在(zai)醛(quan)縮(suo)酶(mei)和(he)磷(lin)酸(suan)丙糖(tang)異(yi)構酶(mei)的作(zuo)用下(xia)轉變(bian)為(wei) 3-磷(lin)酸(suan)甘油(you)醛，再(zai)由 3-磷(lin)酸(suan)甘油(you)醛脫氫酶(mei)和(he)NADH 催(cui)化(hua)生(sheng)成(cheng) 3-磷(lin)酸(suan)甘油(you)酸(suan)、NAD 和(he)磷(lin)酸(suan)，340nm 處的吸(xi)光度變(bian)化(hua)反(fan)映(ying)了PFP 的活(huo)性(xing)的高低(di)。

組(zu)成：

試(shi)劑二(er)：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃避光保存。臨(lin)用前加(jia) 5ml 蒸(zheng)餾(liu)水充(chong)分溶解；用不完(wan)的試劑分裝後(hou)-20℃保存，禁(jin)止(zhi)反(fan)復凍融(rong)。

試(shi)劑三(san)：粉(fen)劑×1 瓶(ping)，-20℃避光保存。臨(lin)用前加(jia) 5 ml 蒸(zheng)餾(liu)水充(chong)分溶解；用不完(wan)的試劑分裝後(hou)-20℃保存，禁(jin)止(zhi)反(fan)復凍融(rong)。

試(shi)劑四：液(ye)體(ti) 0.5ml×1 瓶(ping)，4℃避光保存。試(shi)劑五：液(ye)體(ti) 0.5ml×1 瓶(ping)，4℃避光保存。試(shi)劑六：液(ye)體(ti) 5ml×1 瓶(ping)，4℃避光保存。

自備儀(yi)器(qi)和(he)用品：

天(tian)平(ping)、低(di)溫(wen)離(li)心(xin)機(ji)、研(yan)缽(bo)、紫(zi)外(wai)分光光度計(ji)、1 ml 石(shi)英比(bi)色皿。

酶(mei)液(ye)提取(qu)：

組(zu)織：按照質(zhi)量（g）：提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的比(bi)例（建(jian)議稱(cheng)取(qu)約 0.1g，加(jia)入(ru) 1ml 提取(qu)液(ye)）加入(ru)提取(qu)液(ye)，冰浴(yu)勻漿(jiang)後(hou)於(yu) 4℃，10000g 離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清置(zhi)冰上(shang)待(dai)測(ce)。

細(xi)胞：按照細(xi)胞數(shu)量(liang)（104 個(ge)）：提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的比(bi)例（建(jian)議 500 萬細(xi)胞加(jia)入(ru) 1ml提取(qu)液(ye)），冰浴(yu)超(chao)聲波(bo)破(po)碎細(xi)胞（功率(lv) 300w，超(chao)聲 3 秒(miao)，間隔 7 秒(miao)，總時間 3min）；然(ran)後(hou) 4℃，10000g離(li)心(xin) 10min，取(qu)上清置(zhi)冰上(shang)待(dai)測(ce)。

液(ye)體(ti)：直(zhi)接檢測(ce)。

測(ce)定(ding)步(bu)驟：

分光光度計(ji)預熱(re) 30min，調(tiao)節波(bo)長至 340nm，蒸(zheng)餾(liu)水調(tiao)零(ling)。

取(qu) 1ml 石(shi)英比(bi)色皿，依(yi)次(ci)加(jia)入(ru) 580μl 試劑壹(yi)，100μl 試(shi)劑二(er)，100μl 試劑三(san)，10μl 試劑四，10μl 試(shi)劑五，100μl 試劑六，100μl 粗(cu)酶(mei)液(ye)，充分混勻，記(ji)錄(lu) 340nm 處10s 的吸(xi)光值A1 和(he)310s 的(de)吸(xi)光值A2，△A=A1-A2

計(ji)算(suan)公(gong)式：

按照樣本蛋白濃(nong)度(du)計(ji)算(suan)

酶(mei)活(huo)單(dan)位(wei)定(ding)義：每(mei)毫克(ke)組(zu)織蛋(dan)白每(mei)分鐘消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位(wei)。

PFP（nmol/min/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反(fan)總(zong)÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

按照樣本質(zhi)量計(ji)算(suan)

酶(mei)活(huo)單(dan)位(wei)定(ding)義：每(mei)克(ke)組(zu)織每(mei)分鐘消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位(wei)。

PFP（nmol/min /g 鮮(xian)重）=ΔA÷（ε×d）×V 反(fan)總(zong)÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

按照細(xi)胞數(shu)量(liang)計(ji)算(suan)

酶(mei)活(huo)單(dan)位(wei)定(ding)義：每(mei) 104 個(ge)細(xi)胞每(mei)分鐘消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位(wei)。

PFP（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反(fan)總(zong)÷(V 樣×細(xi)胞數(shu)量(liang)÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細(xi)胞數(shu)量(liang)

按照液(ye)體(ti)體(ti)積(ji)計(ji)算(suan)

酶(mei)活(huo)單(dan)位(wei)定(ding)義：每(mei)毫升(sheng)液(ye)體(ti)每(mei)分鐘消(xiao)耗(hao) 1 nmol 的(de)NADH 定(ding)義為(wei)壹(yi)個(ge)酶(mei)活(huo)力(li)單(dan)位(wei)。

PFP（nmol/min /ml）=ΔA÷（ε×d）×V 反(fan)總(zong)÷V 樣÷T=321.54×ΔA

V 反(fan)總(zong)：反(fan)應體(ti)系(xi)總體(ti)積(ji)，1ml；ε：NADH 摩(mo)爾(er)消(xiao)光系數(shu)，6.22×103 L / mol /cm；d：比(bi)色皿光徑，1cm； V 樣：加入(ru)樣本體(ti)積(ji)，0.1ml；V 樣總：加入(ru)提取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)，1ml；T：反應(ying)時(shi)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhi)濃(nong)度(du)，mg/ml；W：樣本質(zhi)量，g

焦(jiao)磷(lin)酸(suan)果(guo)糖(tang)-6-磷(lin)酸(suan)-1-磷(lin)酸(suan)轉移(yi)酶(mei)試劑盒(he)光合