GR 能(neng)催(cui)化(hua)NADPH 還原(yuan)GSSG 再(zai)生(sheng)GSH，同(tong)時NADPH 脫(tuo)氫(qing)生(sheng)成(cheng)NADP+；NADPH 在(zai) 340 nm 有特(te)征吸(xi)收(shou)峰，相反(fan)NADP+在(zai)該波長無吸收(shou)峰；通過(guo)測(ce)定(ding) 340 nm 吸(xi)光(guang)度下降(jiang)速率(lv)來測定 NADPH 脫(tuo)氫(qing)速(su)率(lv)，從(cong)而(er)計算GR 活性(xing)。
谷胱(guang)gan肽(tai)還原(yuan)酶

谷胱(guang)gan肽(tai)還原(yuan)酶（glutathione reductase, GR）說明(ming)書

分(fen)光(guang)光(guang)度法 50 管/48 樣(yang)

谷胱(guang)gan肽(tai)還原(yuan)酶

正(zheng)式(shi)測定(ding)前務必(bi)取(qu) 2-3 個(ge)預期差異較大(da)的(de)樣本做預測定(ding)測(ce)定(ding)意義(yi)：

GR 是(shi)廣泛存(cun)在(zai)於(yu)真(zhen)核和原(yuan)核生(sheng)物(wu)中(zhong)的(de)壹種黃素蛋(dan)白氧化(hua)還原(yuan)酶，是(shi)谷胱(guang)gan肽(tai)氧化(hua)還原(yuan)循(xun)環(huan)的(de)關鍵酶之壹（通常昆蟲中 GR 被TrxR 取(qu)代(dai)）。GR 催化(hua)NADPH 還原(yuan)GSSG 生(sheng)成(cheng)GSH，有助(zhu)於(yu)維(wei)持體(ti)內(nei) GSH/GSSG比(bi)值。GR 在(zai)氧化(hua)脅迫(po)反(fan)應(ying)中(zhong)對活(huo)性(xing)氧清(qing)除起(qi)關鍵作用，此(ci)外(wai)GR 還參(can)與(yu)抗壞(huai)血(xue)酸－谷胱(guang)gan肽(tai)循(xun)環(huan)途徑(jing)。

測定(ding)原(yuan)理：

GR 能(neng)催(cui)化(hua)NADPH 還原(yuan)GSSG 再(zai)生(sheng)GSH，同時NADPH 脫(tuo)氫(qing)生(sheng)成(cheng)NADP⁺；NADPH 在(zai) 340 nm 有特(te)征吸(xi)收(shou)峰，相反(fan)NADP⁺在(zai)該波長無吸收(shou)峰；通過(guo)測(ce)定(ding) 340 nm 吸(xi)光(guang)度下降(jiang)速率(lv)來測定 NADPH 脫(tuo)氫(qing)速(su)率(lv)，從(cong)而(er)計算GR 活性(xing)。

組成(cheng)：

試(shi)劑二：粉劑×2 瓶，-20℃保(bao)存(cun)。臨用前(qian)加(jia)入 3 ml 蒸餾(liu)水(shui)，混勻(yun)。試(shi)劑三(san)：粉(fen)劑×2 支(zhi)，-20℃保存。臨用前(qian)加(jia)入 1.5 ml 蒸餾(liu)水(shui)，混勻(yun)。

自備儀器(qi)和用品(pin)：

紫外(wai)分(fen)光(guang)光(guang)度計、低溫離心(xin)機(ji)、水(shui)浴(yu)鍋(guo)、移(yi)液(ye)器(qi)、1ml 石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)和蒸(zheng)餾水

粗酶(mei)液(ye)提取(qu)：

組織：按照(zhao)組織質(zhi)量(liang)（g）：提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ml)為 1：5~10 的(de)比(bi)例（建(jian)議(yi)稱取(qu)約(yue) 0.1g 組(zu)織，加(jia)入 1ml 試(shi)劑壹）進行冰浴(yu)勻(yun)漿(jiang)。8000g，4℃離心(xin) 15min，取(qu)上清(qing)，置冰上待(dai)測(ce)。

細菌、真菌：按照(zhao)細胞數量(liang)（104 個(ge)）：提取(qu)液(ye)體(ti)積（ml）為 500~1000：1 的(de)比(bi)例（建(jian)議(yi) 500 萬細胞加(jia)入 1ml 試(shi)劑壹），冰浴(yu)超聲波破碎細胞（功率 300w，超(chao)聲 3 秒，間(jian)隔 7 秒(miao)，總時間(jian) 3min）；然(ran)後(hou) 8000g， 4℃，離心(xin) 15min，取(qu)上清(qing)置於(yu)冰上待(dai)測(ce)。

血(xue)清(qing)等液(ye)體(ti)：直(zhi)接測定(ding)。

操作步(bu)驟(zhou)：

分(fen)光(guang)光(guang)度計預熱 30 min，調(tiao)節(jie)波長到(dao) 340 nm，蒸餾水調零(ling)。

試(shi)劑壹置於(yu) 25℃（普(pu)通(tong)物質）或(huo)者 37℃（哺(bu)乳動物(wu)）中預熱 30min。

測定(ding)管：取(qu) 1ml 石(shi)英(ying)比(bi)色皿(min)，依(yi)次加(jia)入 50μl 試(shi)劑三(san)，100μl 試(shi)劑二， 750μl 試(shi)劑壹，100μl 上清(qing)液(ye)，混勻(yun)，於(yu) 340nm 迅速(su)測定(ding)初(chu)始吸光(guang)度和 180 s 吸(xi)光(guang)度，記(ji)為 A 測(ce) 1 和A 測(ce) 2，△A 測定管= A 測(ce) 1﹣A 測(ce) 2。 (註(zhu)意(yi)加(jia)完上清(qing)液(ye)後(hou)迅速(su)混勻(yun)測定(ding))

計算公(gong)式(shi)：

按蛋(dan)白濃度計算

活性(xing)單位定義(yi)：在(zai)壹定溫度中，pH8.0 條件(jian)下，每(mei)毫克蛋(dan)白每(mei)分(fen)鐘(zhong)催(cui)化(hua) 1nmol NADPH 氧化(hua)為 1 個(ge)酶活單位。

GR 酶活(huo)(nmol/min/mg prot)= [ △A 測(ce)定管÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)×109]÷[Cpr×V 樣(yang)]÷T

= 536×△A 測定(ding)管÷Cpr

按樣本質量(liang)計算

活性(xing)單位定義(yi)：在(zai)壹定溫度中，pH8.0 條件(jian)下，每(mei)克樣本每(mei)分(fen)鐘(zhong)催(cui)化(hua) 1nmol NADPH 氧化(hua)為 1 個(ge)酶活單位。

GR 酶活(huo)(nmol/min/g 鮮(xian)重)= [ △A 測(ce)定管÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)×109] ÷(W×V 樣(yang)÷V 樣總)÷T

= 536×△A 測定(ding)管÷W

(3) 按細胞數量(liang)計算

活性(xing)單位定義(yi)：在(zai)壹定溫度中，pH8.0 條件(jian)下，每(mei) 104 個(ge)細胞每(mei)分(fen)鐘(zhong)催(cui)化(hua) 1nmol NADPH 氧化(hua)為 1 個(ge)酶活單位。

GR 酶活(huo)(nmol/min/104 cell)= [ △A 測(ce)定管÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)×109] ÷(細胞數量(liang)×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T

= 536×△A 測定(ding)管÷細胞數量(liang)

（4）按液(ye)體(ti)體(ti)積計算

活性(xing)單位定義(yi)：在(zai)壹定溫度中，pH8.0 條件(jian)下，每(mei)毫升(sheng)液(ye)體(ti)每(mei)分(fen)鐘(zhong)催(cui)化(hua) 1nmol NADPH 氧化(hua)為 1 個(ge)酶活單位。

GR 酶活(huo)(nmol/min/ml)= [ △A 測(ce)定管÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)×109]÷×V 樣(yang)÷T

= 536×△A 測定(ding)管

ε：NADPH 摩爾(er)消(xiao)光(guang)系數(shu)6.22×103L/mol/cm；V 反(fan)總(zong)：反(fan)應(ying)體(ti)系總(zong)體(ti)積，1000μl=0.001 L；106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清(qing)液(ye)蛋(dan)白濃度（mg/ml）；V 樣：加(jia)入反(fan)應(ying)體(ti)系中(zhong)上清(qing)液(ye)體(ti)積，100μl =0.1 ml；V 樣(yang)總：加(jia)入提取(qu) 液(ye)體(ti)積，1ml；W，樣(yang)本質量(liang)，g；T：反(fan)應(ying)時間(jian)，3 min。

註(zhu)意(yi)事項：

樣品(pin)處理(li)等過(guo)程(cheng)均需要(yao)在(zai)冰上進行，且(qie)須(xu)在(zai)當日測定(ding)酶(mei)活力，勻(yun)漿(jiang)液(ye)避免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融；

試(shi)劑二和試(shi)劑三(san)須(xu)現(xian)配(pei)現用，配(pei)制(zhi)完後(hou)，置於(yu)冰上，未使(shi)用完(wan)的(de) 4℃保存(cun)，三(san)天內(nei)使(shi)用完(wan)。

測定(ding)前(qian)須(xu)先(xian)用 1～2 個(ge)樣做預實驗(yan)，哺(bu)乳動物(wu)組織壹般(ban)須(xu)用試(shi)劑壹稀(xi)釋(shi) 2～5 倍。

細胞中 GR 活性(xing)測定(ding)時，細胞數目(mu)須(xu)在(zai) 300 萬-500 萬之間(jian)，細胞中 GR 的(de)提取(qu)時可(ke)加(jia)試(shi)劑壹後(hou)研磨或超(chao)聲波處(chu)理(li)，不(bu)能(neng)用細胞裂解(jie)液(ye)處理細胞。