TrxR 催化(hua)NADPH 還原DTNB 生(sheng)成(cheng)TNB 和(he)NADP+，TNB 在 412 nm 有特(te)征吸收(shou)峰(feng)，通(tong)過測定 412nm波(bo)長(chang)處TNB 的增加速(su)率(lv)，即(ji)可(ke)計算TrxR 活性(xing)。
硫(liu)氧(yang)還蛋白(bai)氧(yang)化(hua)還原酶(mei)試劑盒(he) 谷胱(guang)gan肽系(xi)列

硫(liu)氧(yang)還蛋白(bai)氧(yang)化(hua)還原酶(mei)（thioredoxin reductase, TrxR）試劑盒(he)說(shuo)明(ming)書

分(fen)光(guang)光(guang)度法 50 管(guan)/48 樣(yang)

硫(liu)氧(yang)還蛋白(bai)氧(yang)化(hua)還原酶(mei)試劑盒(he) 谷胱(guang)gan肽系(xi)列

正(zheng)式測定前務(wu)必(bi)取(qu) 2-3 個(ge)預期(qi)差異較大的(de)樣本做(zuo)預測定測定意(yi)義：

TrxR 是(shi)壹(yi)種(zhong)NADPH 依賴(lai)的(de)包(bao)含FAD 結(jie)構(gou)域(yu)的二聚體硒(xi)酶(mei)，屬(shu)於(yu)吡啶核苷(gan)酸-二硫(liu)化(hua)物氧(yang)化(hua)還原酶(mei)家族成(cheng)員(yuan)，與(yu)硫(liu)氧(yang)還蛋白(bai)以及(ji) NADPH 共(gong)同構(gou)成了(le)硫(liu)氧(yang)還蛋白(bai)系(xi)統。TrxR 與(yu)GR 活性(xing)類(lei)似(si)，催化(hua) GSSG 還原生(sheng)成(cheng)GSH，是(shi)谷(gu)胱(guang)gan肽氧(yang)化(hua)還原循環(huan)關(guan)鍵(jian)酶(mei)之壹(yi)。

測定原理(li)：

TrxR 催化(hua)NADPH 還(hai)原DTNB 生(sheng)成(cheng)TNB 和(he)NADP⁺，TNB 在 412 nm 有特(te)征吸收(shou)峰(feng)，通(tong)過測定 412nm波(bo)長(chang)處TNB 的增加速(su)率(lv)，即(ji)可(ke)計算TrxR 活性(xing)。

組成(cheng)：

試劑三(san)：粉劑×1 瓶(ping)，4℃保(bao)存(cun)。臨(lin)用(yong)前加入(ru) 5 ml 蒸餾水(shui)溶(rong)解。

自備儀器和用(yong)品：

可(ke)見分(fen)光(guang)光度計、低(di)溫(wen)離(li)心(xin)機(ji)、可調節移液(ye)器、1ml 玻璃(li)比(bi)色(se)皿和(he)蒸餾水(shui)。

粗(cu)酶(mei)液(ye)提(ti)取(qu)：

組織：按(an)照組織質量（g）：試劑壹(yi)體積(ji)(ml)為(wei) 1：5~10 的比(bi)例(li)（建(jian)議稱(cheng)取(qu)約(yue) 0.1g 組織，加(jia)入 1ml 試劑壹(yi)）進行(xing)冰(bing)浴勻(yun)漿。8000g，4℃離心 10min，取(qu)上清置(zhi)冰上待測。

細(xi)菌(jun)、真菌(jun)：按照細(xi)胞(bao)數(shu)量（104 個）：試劑壹(yi)體積(ji)（ml）為(wei) 500~1000：1 的比(bi)例(li)（建(jian)議 500 萬(wan)細(xi)胞(bao)加入 1ml 試劑壹(yi)），冰浴(yu)超聲(sheng)波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)胞(bao)（功率(lv) 300w，超聲(sheng) 3 秒(miao)，間隔(ge) 7 秒(miao)，總(zong)時間 3min）；然後(hou) 8000g， 4℃，離心(xin) 10min，取(qu)上清置(zhi)於冰(bing)上待測。

血(xue)清等液(ye)體(ti)：直(zhi)接測定。

TrxR 測定操作：

分(fen)光(guang)光(guang)度計預熱(re) 30 min，調節波(bo)長(chang)到(dao) 412nm，用(yong)蒸餾水(shui)調零(ling)。

試劑壹(yi)在 25℃（壹(yi)般物(wu)種(zhong)）或者 37℃（哺乳(ru)動(dong)物(wu)）預熱(re) 30min。

測定管：取(qu) 1ml 玻(bo)璃(li)比(bi)色(se)皿，加(jia)入(ru) 100μl 試劑二，100μl 試劑三(san)，700μl 試劑壹(yi)，100μl 上清液(ye)，迅(xun)速(su)混勻(yun)後(hou)於 412 nm 測定 10 s 和 310 s 吸光(guang)度，記為(wei)A3 和A4。△A 測定管=A2-A1。

TrxR 活性(xing)計(ji)算公(gong)式：

按(an)蛋(dan)白(bai)濃度計算

活性(xing)單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：在 25℃或(huo)者 37℃中，每毫(hao)克蛋(dan)白每分(fen)鐘(zhong)催化(hua) 1nmol DTNB 還原為(wei) 1 個酶(mei)活單(dan)位(wei)。

TrxR（nmol/min /mg prot）=△A 測定管÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)÷(Cpr×V 樣(yang))÷T

= 147×△A 測定管÷Cpr

按(an)樣(yang)本(ben)質量計算

活性(xing)單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：在 25℃或(huo)者 37℃中，每克(ke)樣本(ben)每分(fen)鐘(zhong)催化(hua) 1nmol DTNB 還原為(wei) 1 個酶(mei)活單(dan)位(wei)。

TrxR（nmol/min /g 鮮(xian)重(zhong)）=△A 測定管÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)÷(W×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總(zong))÷T

= 147×△A 測定管÷W

按(an)細(xi)胞(bao)數(shu)量計算

活性(xing)單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：在 25℃或(huo)者 37℃中，每 104 個(ge)細(xi)胞(bao)每分(fen)鐘(zhong)催化(hua) 1nmol DTNB 還原為(wei) 1 個酶(mei)活單(dan)位(wei)。

TrxR（nmol/min/104 cell）=△A 測定管÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)÷(細(xi)胞(bao)數(shu)量×V 樣÷V 樣(yang)總(zong))÷T

= 147×△A 測定管÷ 細(xi)胞(bao)數(shu)量

按(an)液(ye)體(ti)體積(ji)計算

活性(xing)單(dan)位(wei)定(ding)義(yi)：在 25℃或(huo)者 37℃中，每毫(hao)升液(ye)體(ti)每分(fen)鐘(zhong)催化(hua) 1nmol DTNB 還原為(wei) 1 個酶(mei)活單(dan)位(wei)。

TrxR（nmol/min /ml）=△A 測定管÷ε÷d×V 反(fan)總(zong)÷V 樣(yang)÷T

= 147×△A 測定管

ε：TNB 在 412nm 處的微摩爾消光(guang)系(xi)數(shu)，0.0136 L/μ mol/cm；d：比(bi)色(se)皿光(guang)徑(jing)，1cm；V 反(fan)總(zong)：反(fan)應體(ti)系(xi)總(zong)體(ti)積(ji)（L），1000μl=0.001 L；Cpr：上清液(ye)蛋(dan)白質濃度（mg/ml），需(xu)要(yao)另(ling)外(wai)測定；V 樣：加入(ru)反(fan)應體(ti)系(xi)中上清液(ye)體(ti)積(ji)（ml），100μl=0.1 ml；V 樣總(zong)：加(jia)入(ru)提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ji)，1ml；W，樣本(ben)質量，g；T：反(fan)應時間（min）， 5 min。

註(zhu)意(yi)事項(xiang):

測定前須(xu)先取(qu) 1～2 個(ge)樣(yang)做(zuo)預實驗，哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)組織及(ji)血(xue)液(ye)制(zhi)品TrxR 活力(li)測定時，壹般須(xu)用(yong)蒸餾水(shui)稀釋(shi)5 倍左右(you)；測定過程(cheng)操作須(xu)迅(xun)速(su)。

試劑二和試劑三(san)配(pei)制好後(hou) 3 天內(nei)使(shi)用(yong)完(wan)。

硫(liu)氧(yang)還蛋白(bai)氧(yang)化(hua)還原酶(mei)試劑盒(he) 谷胱(guang)gan肽系(xi)列