GCL 是(shi) GSH 合(he)成的限速(su)酶，GSH 對(dui) GCL 有(you)反(fan)饋(kui)抑制作用。GCL 基因表達(da)受多種因素調(tiao)節，如(ru)氧化劑、抗氧化劑、生(sheng)長(chang)因子和炎(yan)癥因子等。GCL 活性高(gao)低對(dui)GSH 含(han)量和GSH/GSSG 比(bi)值(zhi)有(you)重要影響。
γ-谷an酰(xian)半(ban)胱(guang)an酸連(lian)接酶(mei) 谷(gu)胱(guang)gan肽(tai)系列(lie)

γ-谷an酰(xian)半(ban)胱(guang)an酸連(lian)接酶(mei)（glutamate cysteine ligase，GCL）說(shuo)明書(shu)

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法 50 管/48 樣(yang)

γ-谷an酰(xian)半(ban)胱(guang)an酸連(lian)接酶(mei) 谷(gu)胱(guang)gan肽(tai)系列(lie)

正(zheng)式(shi)測(ce)定前(qian)務必(bi)取(qu) 2-3 個預期差(cha)異(yi)較(jiao)大的(de)樣(yang)本(ben)做(zuo)預測定測(ce)定意義：

GCL 是(shi) GSH 合成(cheng)的限(xian)速(su)酶，GSH 對(dui) GCL 有(you)反(fan)饋(kui)抑制作用。GCL 基因表達(da)受多種因素調(tiao)節，如(ru)氧化劑、抗氧化劑、生(sheng)長(chang)因子和炎(yan)癥因子等。GCL 活性高(gao)低對(dui)GSH 含(han)量和GSH/GSSG 比(bi)值(zhi)有(you)重要影響。

測定(ding)原理(li)：

在(zai)ATP 和Mg²⁺存(cun)在(zai)下(xia)，GCL 催(cui)化谷(gu)an酸和半(ban)胱(guang)an酸合成γ-谷(gu)an酰(xian)半(ban)胱(guang)an酸；同時 ATP 去(qu)磷酸化產生(sheng)無機(ji)磷分(fen)子，通(tong)過(guo)測定(ding)無機(ji)磷增加(jia)速(su)率，即(ji)可(ke)計(ji)算(suan)出(chu) GCL 活性。

組(zu)成：

試(shi)劑二(er)：粉劑×1 瓶，4℃保(bao)存(cun)。臨用前(qian)加(jia) 14ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)充(chong)分(fen)震蕩(dang)溶解。 試(shi)劑三(san)：粉劑×1 瓶，4℃保(bao)存(cun)。臨用前(qian)加(jia)入(ru)蒸(zheng)餾(liu)水(shui) 3.5 ml 充(chong)分(fen)震蕩(dang)溶解。

試(shi)劑五：粉劑×1 瓶，4℃保(bao)存(cun)。臨用前(qian)加(jia)入(ru) 30ml 蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，充(chong)分(fen)震蕩(dang)溶解後，緩緩(huan)加入(ru) 1.0 ml 濃(nong)硫酸（自備），邊(bian)加邊(bian)攪拌。

自備儀(yi)器和用品：

可(ke)見分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、冷凍(dong)離(li)心(xin)機(ji)、水(shui)浴(yu)鍋、移液器、1ml 玻璃比(bi)色(se)皿(min)、濃(nong)硫酸和蒸(zheng)餾(liu)水(shui)。

粗酶液(ye)提(ti)取(qu)：

組(zu)織(zhi)：按照組(zu)織(zhi)質量（g）：試(shi)劑壹(yi)體積(ji)(ml)為 1：5~10 的(de)比(bi)例（建議稱取(qu)約 0.1g 組(zu)織(zhi)，加入(ru) 1ml 試(shi)劑壹(yi)）進(jin)行冰(bing)浴(yu)勻漿。8000g，4℃離心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清(qing)，置(zhi)冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

細菌(jun)、真菌(jun)：按照細胞(bao)數量（104 個）：試(shi)劑壹(yi)體積(ji)（ml）為 500~1000：1 的(de)比(bi)例（建議 500 萬細胞(bao)加入(ru) 1ml 試(shi)劑壹(yi)），冰(bing)浴(yu)超聲(sheng)波(bo)破(po)碎(sui)細胞(bao)（功率(lv) 300w，超聲(sheng) 3 秒，間(jian)隔(ge) 7 秒，總(zong)時間 3min）；然後 8000g， 4℃，離心(xin) 10min，取(qu)上(shang)清(qing)置(zhi)於冰(bing)上(shang)待(dai)測(ce)。

血清等液體：直(zhi)接測(ce)定(ding)。

GCL 測定(ding)操作(zuo)

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計預熱 30min，調節(jie)波(bo)長(chang)到(dao) 660 nm，蒸(zheng)餾(liu)水(shui)調(tiao)零。

空白管：取(qu) 1.5mlEp 管(guan)，依(yi)次(ci)加入試(shi)劑壹(yi) 240 µl、試(shi)劑二(er) 260µl、試(shi)劑三(san) 60µl 和蒸(zheng)餾(liu)水(shui) 120µl，混(hun)勻(yun)後 蓋緊(jin)，37℃水(shui)浴(yu)準確(que)反(fan)應(ying) 15 min； 再加入(ru)試(shi)劑四 300µl，混勻(yun)後，25℃、8000g，離心(xin) 10 min，取(qu)上(shang)清(qing) 500µl，

加入(ru)試(shi)劑五 500µl，混(hun)勻後蓋緊(jin)，45℃水(shui)浴(yu) 10min，冷卻(que)後測定(ding) 660 nm 處(chu)吸光(guang)值(zhi)，記(ji)為(wei) A 空白管。

測定(ding)管：取(qu) 1.5mlEp 管(guan)，依(yi)次(ci)加入試(shi)劑壹(yi) 240 µl、試(shi)劑二(er) 260µl、試(shi)劑三(san) 60µl 和上(shang)清(qing)液(ye) 120µl，混勻後 蓋緊(jin)，37℃水(shui)浴(yu)準確(que)反(fan)應(ying) 15 min； 再加入(ru)試(shi)劑四 300µl，混勻(yun)後，25℃、8000g，離心(xin) 10 min，取(qu)上(shang)清(qing) 500µl，

加入(ru)試(shi)劑五 500µl，混(hun)勻後蓋緊(jin)，45℃水(shui)浴(yu) 10min，冷卻(que)後測定(ding) 660 nm 處(chu)吸光(guang)值(zhi)，記(ji)為(wei) A 測(ce)定(ding)管。

註意：空白管只(zhi)需(xu)要測定壹次(ci)。

GCL 活性計算公式(shi)：

標(biao)準曲(qu)線(xian)：y=0.1427x，R2=0.9987

(1). 按蛋(dan)白濃(nong)度計(ji)算

活性單位(wei)定(ding)義：37℃下(xia)，每毫(hao)克蛋白每分(fen)鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1μg 無機(ji)磷的(de)GCL 酶活量為(wei) 1 個酶活單(dan)位(wei)。

GCL（μg/min /mg prot）=[（A 測定(ding)管-A 空白管）÷0.1427×V 反(fan)總(zong)]÷(Cpr×V 樣(yang))÷T

=3.815×（A 測定(ding)管-A 空白管）÷Cpr

按樣(yang)本(ben)質量計(ji)算

活性單位(wei)定(ding)義：37℃下(xia)，每克組(zu)織(zhi)每分(fen)鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1μg 無機(ji)磷的(de)GCL 酶活量為(wei)為 1 個酶活單(dan)位(wei)。

GCL（μg/min /g 鮮重(zhong)）= [（A 測(ce)定(ding)管-A 空白管）÷0.1427×V 反(fan)總(zong)]÷(W×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T

= 3.815×（A 測定(ding)管-A 空白管）÷W

按細(xi)胞(bao)數量計(ji)算

活性單位(wei)定(ding)義：37℃下(xia)，每 104 個細胞(bao)每分(fen)鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1μg 無機(ji)磷的(de)GCL 酶活量為(wei) 1 個酶活單(dan)位(wei)。

GCL（μg/min /104 cell）=[（A 測定(ding)管-A 空白管）÷ 0.1427×V 反(fan)總(zong)]÷(細胞(bao)數量×V 樣(yang)÷V 樣(yang)總)÷T

= 3.815×（A 測定(ding)管-A 空白管）÷細胞(bao)數量

按照液體體積(ji)計算(suan)

活性單位(wei)定(ding)義：37℃下(xia)，每毫(hao)升(sheng)液體每(mei)分(fen)鐘(zhong)催(cui)化產生(sheng) 1μg 無機(ji)磷的(de)GCL 酶活量為(wei) 1 個酶活單(dan)位(wei)。

GCL（μg/min /ml）= [（A 測定(ding)管-A 空白管）÷ 0.1427×V 反(fan)總(zong)]÷V 樣(yang)÷T

=  3.815×（A 測定(ding)管-A 空白管）

0.1427：回歸(gui)方程(cheng)系數(shu)；V 反(fan)總(zong)：反(fan)應(ying)總(zong)體積(ji)（ml）980µl=0.980ml；Cpr：上(shang)清(qing)液(ye)蛋白質濃(nong)度，mg/ml；V樣(yang)：加入(ru)反(fan)應(ying)體系中上(shang)清(qing)液(ye)體積(ji)，120µl =0.12 ml；V 樣(yang)總：加(jia)入(ru)提(ti)取(qu)液(ye)體積(ji)，1ml；W：樣(yang)本(ben)質量，g；T：反(fan)應(ying)時間：15min。

註意事項：

樣(yang)品處(chu)理(li)等過(guo)程均(jun)需(xu)要在(zai)冰(bing)上(shang)進(jin)行，且(qie)須(xu)在(zai)當(dang)日(ri)測(ce)定(ding)酶(mei)活(huo)力，以(yi)免(mian)影響其(qi)活(huo)力。如(ru)果是(shi)勻(yun)漿液，避免(mian)反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)。

所有(you)試(shi)劑配制完後，除(chu)表明 4℃保(bao)存(cun)外(wai)，請(qing)於 1 天內(nei)用完。

實驗(yan)過(guo)程請(qing)帶(dai)手套(tao)，試(shi)劑三(san)中有(you)強腐(fu)蝕(shi)性物質，註意不要濺到(dao)皮(pi)膚(fu)上(shang)或(huo)眼(yan)睛內(nei)。

測定(ding)吸光(guang)值(zhi)時請於水(shui)浴(yu)後 10～40 分(fen)鐘(zhong)內(nei)測完。

樣(yang)本(ben)測定(ding)前(qian)先(xian)取(qu) 1-2 個樣(yang)做(zuo)預實驗(yan)，如(ru)吸光(guang)值(zhi)太(tai)高(gao)，應(ying)先(xian)用試(shi)劑壹(yi)(或(huo)者(zhe)生(sheng)理(li)鹽(yan)水(shui))稀(xi)釋到(dao)適(shi)當(dang)倍(bei)數，使得(de)吸光(guang)值(zhi)在(zai)標(biao)準曲(qu)線(xian)範圍(wei)內，哺(bu)乳(ru)動物組(zu)織(zhi)和血液壹般(ban)稀(xi)釋 3～5 倍(bei)。

試(shi)劑三(san)配制過(guo)程中，可(ke)能(neng)會產生(sheng)黑(hei)色固體，其(qi)不(bu)影響結果(guo)，註(zhu)意吸取(qu)時不要將(jiang)黑(hei)色固體吸入(ru)。

細胞(bao)中GCL 活性測定時，細胞(bao)數目(mu)須(xu)在(zai) 300 萬-500 萬(wan)之間(jian)，細胞(bao)中GCL 的提(ti)取(qu)時可(ke)加(jia)試(shi)劑壹(yi)（或(huo)生(sheng)理(li)鹽(yan)水(shui)）後研(yan)磨(mo)或(huo)超(chao)聲(sheng)波(bo)處(chu)理(li)，不(bu)能(neng)用細胞(bao)裂解(jie)液處(chu)理(li)細(xi)胞(bao)；

γ-谷an酰(xian)半(ban)胱(guang)an酸連(lian)接酶(mei) 谷(gu)胱(guang)gan肽(tai)系列(lie)