AsA 作(zuo)為(wei)植(zhi)物細(xi)胞(bao)壹個(ge)重(zhong)要(yao)生(sheng)理指(zhi)標(biao)，其 AsA 的含量、氧化還原(yuan)狀態(tai)(AsA/DHA 比率(lv))及其(qi)合成(cheng)與代謝相(xiang)關酶(mei)類活(huo)性(xing)的(de)變化涉及植(zhi)物對(dui)壹(yi)系(xi)列環(huan)境(jing)脅迫的(de)響(xiang)應。DHA 是AsA 的可逆的氧化型(xing)，在生(sheng)物(wu)體內(nei)，與(yu)抗(kang)壞(huai)血(xue)酸共(gong)同組成(cheng)氧(yang)化還原(yuan)系(xi)統(tong)，具有(you)電(dian)子受(shou)體的作(zuo)用(yong)。
脫氫(qing)抗(kang)壞(huai)血(xue)酸含(han)量測定(ding)試(shi)劑(ji)盒

脫氫(qing)抗(kang)壞(huai)血(xue)酸（dehydroascorbate，DHA）含(han)量測定(ding)試(shi)劑(ji)盒說明(ming)書(shu)

分(fen)光(guang)光度(du)法(fa) 50 管/48 樣

脫氫(qing)抗(kang)壞(huai)血(xue)酸含(han)量測定(ding)試(shi)劑(ji)盒

正(zheng)式(shi)測定前(qian)務(wu)必(bi)取(qu) 2-3 個預期差(cha)異較(jiao)大(da)的樣本(ben)做預測定(ding)測定(ding)意(yi)義(yi)：

AsA 作為(wei)植(zhi)物細(xi)胞(bao)壹個(ge)重(zhong)要(yao)生(sheng)理指(zhi)標(biao)，其 AsA 的含(han)量、氧化還原(yuan)狀態(tai)(AsA/DHA 比率(lv))及其(qi)合成(cheng)與代謝相(xiang)關酶(mei)類活(huo)性(xing)的(de)變化涉及植(zhi)物對(dui)壹(yi)系(xi)列環(huan)境(jing)脅迫的(de)響(xiang)應。DHA 是AsA 的可逆的氧化型(xing)，在生(sheng)物(wu)體內(nei)，與(yu)抗(kang)壞(huai)血(xue)酸共(gong)同組成(cheng)氧(yang)化還原(yuan)系(xi)統(tong)，具有(you)電(dian)子受(shou)體的作(zuo)用(yong)。

測定(ding)原(yuan)理：

DTT 還原(yuan)DHA 生(sheng)成(cheng)AsA，通過測(ce)定(ding)體系(xi)中(zhong)AsA 的生(sheng)成(cheng)速(su)率(lv)，即(ji)可(ke)計算出(chu) DHA 含量。

組成(cheng)：

試(shi)劑(ji)三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用(yong)前(qian)加入 10ml 蒸(zheng)餾(liu)水充分(fen)溶(rong)解。

標準(zhun)品(pin)：粉劑×1 瓶， 4℃保存。臨用(yong)前(qian)加入 5.743 ml 蒸(zheng)餾(liu)水充分(fen)溶(rong)解；吸取 0.1 ml 上(shang)述溶(rong)液，加入 0.9 ml蒸(zheng)餾(liu)水，混(hun)勻，即(ji)為(wei) 100μmol/L DHA。

自(zi)備(bei)儀器和(he)用(yong)品：

低(di)溫(wen)離(li)心機、紫外(wai)分(fen)光(guang)光度(du)計(ji)、1ml 石(shi)英(ying)比色皿、可(ke)調(tiao)式(shi)移(yi)液(ye)器、研缽、冰(bing)和(he)蒸(zheng)餾水(shui)。

樣品(pin)中(zhong) DHA 提(ti)取(qu)：

組織(zhi)：按照組織(zhi)質(zhi)量（g）：試(shi)劑(ji)壹體積(ml)為(wei) 1：5~10 的(de)比例(li)（建(jian)議稱(cheng)取約(yue) 0.1g 組織(zhi)，加入 1ml 試(shi)劑(ji)壹）進行冰(bing)浴(yu)勻(yun)漿(jiang)。12000g，4℃離(li)心 20min，取上清置(zhi)冰(bing)上(shang)待測(ce)。

細(xi)菌(jun)、真(zhen)菌(jun)：按照細(xi)胞(bao)數量（104 個）：試(shi)劑(ji)壹體積（ml）為(wei) 500~1000：1 的(de)比例(li)（建(jian)議 500 萬(wan)細(xi)胞(bao)加入 1ml 試(shi)劑(ji)壹），冰(bing)浴(yu)超(chao)聲波(bo)破(po)碎(sui)細(xi)胞(bao)（功率(lv) 300w，超(chao)聲 3 秒(miao)，間(jian)隔(ge) 7 秒(miao)，總(zong)時(shi)間(jian) 3min）；12000g， 4℃離心 10min，取上清液(ye)置(zhi)於冰(bing)上(shang)待測(ce)。

血(xue)清等(deng)液體：直(zhi)接(jie)測(ce)定。

DHA 測定(ding)操作：

分(fen)光(guang)光度(du)計(ji)預熱 30 min，調(tiao)節(jie)波(bo)長到(dao) 265 nm，蒸餾(liu)水(shui)調(tiao)零(ling)。

試(shi)劑(ji)二在 25℃水(shui)浴(yu)鍋中(zhong)預熱 30 min。

標準(zhun)管(guan)：依(yi)次在 1ml 石(shi)英(ying)比色皿加入 100μl 標(biao)準(zhun)液、800μl 預熱的(de)試(shi)劑(ji)二和(he) 100μl 試(shi)劑(ji)三，迅速(su)混(hun)勻後於 265nm 比色，記錄(lu) 10s 和(he) 130s 的(de)吸光值A1 和(he)A2，△A 空(kong)白(bai)管=A2-A1。

測定(ding)管(guan)：依(yi)次在 1ml 石(shi)英(ying)比色皿加入 100μl 上(shang)清(qing)液、800μl 預熱的(de)試(shi)劑(ji)二和(he) 100μl 試(shi)劑(ji)三，迅速(su)混(hun)勻後於 265nm 比色，記錄(lu) 10s 和(he) 130s 的(de)吸光值A3 和(he)A4，△A 測(ce)定管(guan)=A4-A3。

註意(yi)：標準管只需測定(ding)壹次。

計算(suan)公式：

按蛋白(bai)濃度(du)計(ji)算

DHA(nmol/mg prot) =[C 標準(zhun)液(ye)×△A 測(ce)定管(guan)÷△A 標(biao)準管×V 標準]÷（Cpr×V 樣）

=100×△A 測定(ding)管(guan)÷△A 標(biao)準管(guan)÷Cpr

按樣本(ben)質(zhi)量計算(suan)

DHA(nmol/g 鮮(xian)重) =[C 標(biao)準液(ye)×△A 測定(ding)管÷△A 標(biao)準管×V 標(biao)準(zhun)]÷(W×V 樣÷V 樣總(zong))

=100×△A 測定(ding)管(guan)÷△A 標(biao)準管(guan)÷W

按細(xi)胞(bao)數量計算(suan)

DHA(nmol/104 cell) =[C 標準(zhun)液(ye)×△A 測(ce)定管(guan)÷△A 標(biao)準管×V 標準]÷(W×V 樣÷V 樣總(zong))

=100×△A 測定(ding)管(guan)÷△A 標(biao)準管(guan)÷細(xi)胞(bao)數量

（4）按液(ye)體體積計(ji)算(suan)

DHA(nmol/ml) =[C 標準(zhun)液(ye)×△A 測(ce)定管(guan)÷△A 標(biao)準管×V 標準]÷V 樣

=100×△A 測定(ding)管(guan)÷△A 標(biao)準管(guan)

C 標準(zhun)液(ye)：100μmol/L；V 標(biao)準：加入反應體系(xi)中(zhong)標準液體積，0.1ml；V 樣總(zong)：上(shang)清液總體積，1.0 ml=0.001 L；V 樣：加入反應體系(xi)中(zhong)上清液體積，0.1ml；W：樣品(pin)質(zhi)量，g。

註意(yi)事項(xiang)：

臨用(yong)前(qian)配制(zhi)的試(shi)劑(ji)未使(shi)用完(wan)的 4℃保存，3 天(tian)內(nei)使(shi)用(yong)完(wan)。

最(zui)di檢出(chu)限(xian)為(wei) 10μmol/L。

脫氫(qing)抗(kang)壞(huai)血(xue)酸含(han)量測定(ding)試(shi)劑(ji)盒